發布時間 : 2020-06-24 閱讀次數 : 124
elisa作為經典的免疫檢測方法,看起來很平常,然而真正做好它并不容易.有哪些方法可以借鑒呢？我們總結了幾點：
1. 確定您的樣本類型和試劑盒可以兼容
常見樣本類型有血清,血漿,細胞培養上清,如果是廠家實驗驗證過的,可根據產品說明購買使用.【注意：血漿制備用到的抗凝劑有 EDTA 檸檬酸鹽 肝素等多種,相應的血漿性質存在差異,需單獨確認兼容性】.
2. 試劑盒檢測范圍需要匹配樣本中標志物濃度
elisa試劑盒的定量檢測范圍需參考標準曲線,在標準曲線最低和最高濃度區間內屬于線性范圍,其中的值是可信和可定量的.濃度高于線性范圍的樣品要稀釋到線性范圍內來測量,而濃度低于線性范圍的樣品,其測量值不能用于計算濃度,只能用做參考.有一種常見的相關情況是：健康人樣本中很多標志物的濃度偏低,測量值低于標準曲線最低值.
3. 樣本收集有講究
以血清為例,樣本收集可參考試劑盒說明書,但需注意以下要點.樣本盡量用無菌管收集,避免細菌的酶類和代謝產品對結果的影響.采集過程要避免溶血,因為紅細胞溶解釋放的活性物質可能會影響檢測.保存過程中如有沉淀,應離心后取上清液.樣本若不立即測定,建議按照每次使用量分裝保存在 -20℃,每次檢測使用一管,即避免交叉污染和反復凍融,有能保證檢測結果的平行可比性.
4. 實驗前要準備好相應試劑
提前將所有試劑平衡到室溫環境,這個過程大致需半小時左右.洗液是濃縮液,如有結晶析出,需完全溶解后再進行稀釋.A B 兩管顯色底物在使用前15分鐘按 1:1 配成混合液.為保證蛋白標準品溶液配制質量,蛋白標準品為凍干粉,重溶前需將管子離心,加入說明書指定的緩沖液,慢速在搖床上搖勻或顛倒混勻,至少 15 分鐘,不建議用槍頭吹打.溶解后如需保存,按每次使用量分裝后根據說明書要求的溫度保存.梯度稀釋蛋白標準品時,建議用聚丙烯管（對蛋白吸附力很低）,每步都要充分混勻且更換新槍頭,確保梯度準確性.
5. 儀器設備的準備也必不可少
相關設備包括移液器 洗板機/搖床和酶標儀.移液器的準確性對于ELISA實驗結果的可靠性十分關鍵,需要確保定期校準維護.搖床的使用是為了讓反應體系快速達到平衡,獲得穩定 可重復的結果.不用搖床對實驗通常的影響是,OD 值低,CV 大.酶標儀等設備使用前提前 15 分鐘開機預熱.
6. 剩余的試劑盒材料要妥善保存
標準品分裝后按說明書要求的溫度保存,這樣可以避免污染,對要求冷凍保存的標準品還可以避免反復凍融；酶標板放回錫箔紙袋,加入干燥劑,封緊封口,4℃保存.忌未將酶標板完全平衡至室溫,就放回錫箔紙袋,因為此時由于溫度差,酶標板上會有水汽,不利于穩定保存.
7. 預實驗：通常預實驗包括全部標準曲線和小量樣本.
預實驗有兩個主要目的,一來是熟悉實驗流程,發現可能忽略的問題；二來是測試樣本和試劑盒是否匹配,一旦出現不匹配的情況,不至于浪費過多樣本.另外是對樣品中目的分析物的豐度作一下大致了解,以確定合適稀釋度.
8. 孵育時要保證溫度均勻,防止揮發變干
孵育時壓緊封口膜.多塊板一起實驗時,要平放各板,不要疊放,以免因溫度不均造成漂移或邊緣效應.
9. 加樣要快速準確,避免氣泡
加樣時間宜控制在 15 分鐘內.加樣前要將樣本混勻,特別是凍存后融化的樣本（自然融化的血清等樣本會有分層現象）,應上下顛倒充分混勻,注意動作輕緩,避免產生氣泡.如凍存融化后的樣本有沉淀,可以再次離心.整個加樣過程都要注意避免產生氣泡.氣泡會影響蛋白的相互結合,而影響反應進行.
10. 手動洗板的操作指南
加洗液要快速,沒有多道移液器可以使用洗瓶.洗液應新鮮配制,以免被其他試劑污染,或染菌.加好洗液后浸泡 30s-1min.甩板倒液要迅速干脆.倒液后在吸水紙上拍板,選用無粉塵和碎屑的優質吸水紙.需要用力拍板,使孔內沒有可見液體掛壁；但也不能太重,不能讓樣品干太久.酶標板拍干后立即做后續的加液.
11. 顯色反應的關鍵點
elisa試劑盒實驗是個酶促底物顯色反應,隨時間增加,顯色變深,所以選擇最佳時間終止反應是得到準確的標準曲線和樣本濃度的重要因素.終止過程要完全.使用的 TMB 底物時完全終止點是黃色,不會有任何程度的藍色或綠色,終止過程中必要時可以震蕩 96 孔板,或用槍頭抽吸混勻（終止液含強酸,避免腐蝕）.
